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叮咚！IP实验小贴士来啦

2021-12-07

免疫沉淀法（Immunoprecipitation，IP），是从不均一的细胞或组织提取物中使用靶标特异性抗体富集特定蛋白质的一项技术，常用于蛋白质富集，靶向蛋白研究（如翻译后修饰等），免疫共沉淀还可用于蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白质复合物研究，蛋白复合体新发现等。针对IP实验操作，我们有哪些建议呢？

细胞裂解物制备

Cell Lysis Buffer（10X）（#9803）和 RIPA Buffer（10X）（＃9806）均可用于制备总的细胞裂解液进行Western blotting实验。但是，我们推荐使用#9803用于IP或Co-IP实验。因为RIPA缓冲液含有离子型脱氧胆酸钠，破坏核膜、防止蛋白质降解并且不干扰蛋白质的免疫反应性和生物学活性的同时，可以使激酶变性并阻止蛋白质-蛋白质相互作用。

超声处理在提取核蛋白和膜蛋白时至关重要。超声可以充分破碎细胞核和DNA，使蛋白尽可能的释放出来，且不会破坏绝大部分的蛋白与蛋白相互作用。

IP样品一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要，样品可以分装保存在-80°C，避免反复冻融。

对照设置

同型对照抗体用来预估由于Fc受体结合或其他蛋白-蛋白相互作用所致的靶标一抗的非特异性结合。IgG对照缺少抗体的特异性结合区域，但它与一抗类型匹配。在进行IP实验时，将裂解液、珠子与合适的IgG对照抗体而非靶标抗体一起孵育。如果IP后的样本中有目的蛋白，表明目的蛋白与抗体的IgG部分有非特异性结合。

IP实验中用到的同型对照应该与一抗IgG亚型保持一致，对于兔单克隆抗体，建议使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP Isotype Control (#3900)，对于兔多克隆抗体，建议使用Normal Rabbit IgG（#2729）。CST还提供了小鼠IgG1（#5415），IgG2a（#61656），IgG2b（#53484）和IgG3（#37988）的IgG对照。

在使用IgG对照时，需要将其浓度调整到与进行IP使用的一抗的浓度一致，以进行准确的比较。

预纯化

虽然预纯化不是必须的，但是通过beads预纯化，可以降低样本中蛋白与beads的任何非特异性结合，确保IP数据的准确性，排除由于靶蛋白与IP beads非特异性的结合造成的假阳性。

与目标蛋白抗体共孵育

建议在IP管中加入抗体，孵育过夜，让抗体更加有效的与目的蛋白相互作用，结合目的蛋白，然后通过珠子沉淀抗体和蛋白的复合物，得率和蛋白纯度会比较高。

免疫沉淀

选择使用什么beads是很重要的一点。对于兔来源的抗体，推荐使用protein A偶联的beads，琼脂糖珠#9863，磁珠#73778。磁珠无需离心，但需搭配磁力架（#14654或者#7017）。对于小鼠来源的抗体，推荐使用protein G偶联的beads，琼脂糖珠#37478，或者磁珠#70024。

微珠清洗

盐离子浓度和去垢剂种类、浓度不同，造成洗涤的严格度不同。RIPA Buffer（#9806）洗涤严格度高，用于蛋白富集或翻译后修饰分析；Cell lysis buffer（#9803）可用于Co-IP的微珠清洗；PBS（#9808）严格度最低，用于蛋白复合物分析。

Western blot 分析

用蛋白免疫印迹法进行分析。对于分子量接近50 kDa的蛋白，我们建议使用Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262)或Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)作为二抗，以将变性重链产生的遮盖作用减到最小。对于分子量接近25 kDa的蛋白，建议使用Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)或Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) (#5127)。当使用鼠源一抗检测分子量在50 kDa范围内的蛋白质时，我们建议使用Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802)作为二抗，以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

小结

Cell Signaling Technology（CST）提供经IP严格验证的抗体，包括对照、二抗、带表位标签的偶联为主的抗体，同时还提供通过IP实验彻底评估的试剂、缓冲液、微珠和其他配套产品。

基因有限公司作为Cell Signaling Technology（CST）优质一级代理商，为您的实验提供更优的支持和帮助。想要更多相关知识和资料，欢迎留言或联系您身边的基因有限公司员工。

同型对照抗体
CST#3900	Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control
CST#3423	Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Sepharose® Bead Conjugate)
CST#8726	Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Magnetic Bead Conjugate)
CST#4096	Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Biotinylated)
CST#2729	Normal Rabbit IgG
CST#5415	Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control
CST#5873	Mouse IgG (Magnetic Bead Conjugate)
CST#3420	Mouse IgG (Sepharose® Bead Conjugate)
CST#4097	Mouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (Biotinylated)
CST#61656	Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control
CST#37988	Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control
CST#53484	Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control
二抗
CST#3678	Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb
CST#5127	Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate)
CST#45262	Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb
CST#93702	Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (HRP Conjugate)
CST#58802	Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate)
CST#14708	Anti-rabbit IgG (H+L), Biotinylated Antibody
CST#14709	Anti-mouse IgG (H+L), Biotinylated Antibody
表位标签抗体，偶联微珠抗体
CST#70569	DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG®M2 Antibody) (Sepharose®Bead Conjugate)
CST#2908	DYKDDDDK Tag Antibody (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG® M2 Antibody) (Biotinylated)
CST#2912	GFP (D5.1) Rabbit mAb (Biotinylated)
CST#11847	GST-Tag (26H1) Mouse mAb (Magnetic Bead Conjugate)
CST#5017	HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb (Biotinylated)
CST#11846	HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate)
CST#3956	HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate)
CST#8811	His-Tag (27E8) Mouse mAb (Magnetic Bead Conjugate)
CST#4079	His-Tag (27E8) Mouse mAb (Sepharose® Bead Conjugate)
CST#15070	His-Tag (D3I1O) XP® Rabbit mAb (Biotinylated)
CST#82437	His-Tag (D3I1O) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate)
CST#3946	Myc-Tag (71D10) Rabbit mAb (Biotinylated)
CST#5698	Myc-Tag (9B11) Mouse mAb (Magnetic Bead Conjugate)
CST#3400	Myc-Tag (9B11) Mouse mAb (Sepharose® Bead Conjugate)
其他微珠试剂
CST#9863	Protein A Agarose Beads
CST#73778	Protein A Magnetic Beads
CST#37478	Protein G Agarose Beads
CST#70024	Protein G Magnetic Beads
CST#5947	Streptavidin (Magnetic Bead Conjugate)
CST#3419	Streptavidin (Sepharose® Bead Conjugate)
CST#5946	Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Sepharose® Bead Conjugate)
CST#6990	Anti-rabbit IgG F(ab')2 Fragment (Sepharose® Bead Conjugate)
缓冲液、试剂与其他免疫沉淀实验用品
CST#5872	Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)
CST#5870	Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)
CST#5871	Protease Inhibitor Cocktail (100X)
CST#9038	Cell Fractionation Kit
CST#9803	Cell Lysis Buffer (10X)
CST#9806	RIPA Buffer (10X)
CST#9808	Phosphate Buffered Saline (PBS-20X)
CST#9852	Chaps Cell Extract Buffer (10X)
CST#8553	PMSF
CST#7017	6-Tube Magnetic Separation Rack
CST#14654	12-Tube Magnetic Separation Rack

基因有限公司于1992年在中国香港成立，是国内专业性的生命科学领域仪器、试剂耗材供应商。代理逾七十家欧美等地专业生产厂家具有国际先进水平的高科技产品，涵盖分子、细胞、免疫、诊断等多个研究及应用领域。基因有限公司一贯秉持“基因燃亮生命•生物技术连接世界”的理念，力求将更新更先进的技术方法推荐到国内，为广大客户提供包括技术咨询、产品选配、售后培训及维护的专业服务体系，服务网络遍及全国各地二十多个大中城市，为您提供完整而专业的服务。基因有限公司希望通过自己的不懈努力，为国内客户提供更好的产品，更便捷，更专业的服务，为各位的成功铺路搭桥，也为中国的生命科学事业和生物医药产业尽一己之力！