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【方法推荐】APAC法—为蛋白组学提供直接、可重复且无毒的FFPE样品制备方案

2021-12-06

FFPE（Formalin-Fixed,Paraffin-Embedded福尔马林固定，石蜡包埋）是保存固体组织的常用方法，因此FFPE样本是目前转化医学领域和疾病病理诊断中的重要样本，是医学研究和药物研究精确有效生物学信息的重要基础。

大量FFPE组织样本为临床蛋白组学研究也提供了宝贵的资源。但是，FFPE组织并不好处理。FFPE组织中石蜡是否有效去除是蛋白组学质谱分析前样本制备的关键因素。

业界公认二甲苯处理是脱蜡的有效办法，但是二甲苯不仅有毒，反复多次脱蜡会造成样本损失，因此处理过程中很难保证重复性。

Matthias Mann 教授领衔团队提出了一种替代二甲苯的无毒蛋白样本制备方法——基于Adaptive Focused Acoustics® (AFA®)超声技术的修饰后蛋白富集与捕获方法（APAC）。

该方法完全消除了现有的依靠二甲苯脱蜡的缺点，保证了蛋白质组的分析深度、解交联效率和蛋白质丰度的动态范围，同时也提高了重复性。APAC可以根据样本量的大小进行程序上的调整，同时可使用Covaris 96孔板，应用于临床癌症的队列研究。

APAC实验流程：将人类腺瘤FFPE样本制备的多份蜡卷加入96孔板中（图1A），通过加热处理(95℃) 结合AFA超声处理进行解交联同时乳化石蜡，处理后获得乳白色溶液（图1A,B），表明石蜡被有效的乳化并从组织中分离。为了从该溶液中纯化蛋白质，优化了依赖于变性蛋白质在磁珠上富集（图1A,C）的PAC方案。蛋白结合在磁珠上后用异丙醇洗涤除去残留的石蜡，并在50℃下孵育促进洗涤。随着乳状上清液逐渐变得澄清，石蜡也被逐渐清除至完全清除（图 1A,D）。最后，在磁珠上进行胰酶消化，得到纯净的肽溶液，在LC-MS上机之前通过 SDB-RPS Stage Tips对其进行脱盐（图1A,E）。

为了测试不含二甲苯的工作流程是否能与普通的二甲苯脱蜡相媲美，研究团队使用了来自同一组织块的样本，在APAC工作流程之前分别对其进行了脱蜡。值得注意的是，两种不同的脱蜡方法都有着高度相似的多肽和蛋白质识别率（图2A、B）以及蛋白质丰度范围（图2C）。在每轮测量中平均量化了3,900个蛋白质和20,842个多肽，蛋白质丰度超过5个数量级。已知的腺瘤标志物，例如EGFR、β-catenin (CTNNB1) 和E-Cadherin (CDH1)，在两种方案中都显示出相似的蛋白水平（图2C）。

为了进一步评估APAC工作流程的可重复性，研究团队又对结直肠腺瘤组织进行了测试。从一个结直肠腺瘤的三张FFPE组织连续切片中分别取了7份样本。除了切片1中的第4号样本外，其他所有样本都定量了超过3,500种蛋白质（下图 A）。这三张切片上不同位置的样本的生物学变异系数分别为32.6%、19.8%和24.5%（图 B）。在鉴定出的4681个蛋白中，三张切片都定量出了4353（93%）个蛋白（图C）。所有蛋白质组检测的皮尔森相关性中位数为0.96，表明该方法的高重复性（图D）。

结论

AFA聚焦超声裂解结合修饰性蛋白富集捕获(PAC)技术，是一种全新的FFPE样本蛋白质谱分析前处理方法，该方法无需使用二甲苯，即可有效地从组织中乳化分离石蜡，并从石蜡溶液中纯化蛋白质，既保证了蛋白质组的分析深度、解交联效率和蛋白质丰度的动态范围，同时也提高了重复性。这个全新的方法可以使用单管处理，也兼容8联排管甚至是96孔板，为实现基于质谱的高通量蛋白质组学研究奠定了基础。 因此，此方案代表了一种无毒、可重复和高通量的基于质谱的蛋白质组学的FFPE组织分析方法。

数据来源：

AFA-sonication Followed by Modified Protein Aggregation Capture (APAC) Enables Direct, Reproducible and Non-toxic Sample Preparation of FFPE Tissue for Mass Spectrometry based Proteomics

作者：Lisa Schweizer , Fabian Coscia , Johannes Mü ller , Sophia Doll , Michael Wierer * and Matthias Mann

机构：Department of Proteomics and Signal Transduction, Max Planck Institute of Biochemistry, D-82152, Martinsried, Germany, Clinical Proteomics Group, The Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark, 2200 .Correspondence to mmann@biochem.mpg.de or wierer@biochem.mpg.de.

自动聚焦声学技术（Adaptive Focused Acoustics,AFA)

自动聚焦声学技术（Adaptive Focused Acoustics,AFA)，是在传统超声波处理基础上的技术革新，通过球面固态超声换能器将声波聚集到样本区域，对样本进行处理。聚焦声波能够以极低的能量输入获得良好的处理效果，避免传统超声能量过剩引起的样本处理过度及热损伤。Covaris AFA通过精确的计算机控制系统和自动化的仪器操作，为样本处理提供高效可控、重复性优良、温度恒定及无污染的处理环境。

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