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[Nature Communications] 看Covaris如何在多能细胞超转录研究中大显神通

2021-10-26

增殖的干细胞和祖细胞作为新生细胞的摇篮，具有很高的生物合成需求，而干细胞/祖细胞应对这种需求的一种方法是进入一种超转录状态。以往的研究发现，超转录在胚胎干细胞(ES)、植入后的上胚层、最终造血干细胞的出现、原始生殖细胞和神经发生中发生并发挥重要作用，并且可能在发育、再生和疾病的其他环境中发生，但超转录的分子调控机制仍然未知。

Chd1作为一种ATP依赖的染色质重塑因子，参与促进超转录过程，但其在超转录细胞中的分子功能仍然不清楚。另外，以往的研究表明，DNA断裂和转录之间很可能存在普遍联系，但目前还不清楚细胞如何协调DNA断裂的发生及其与转录修复的关系，这种协调在超转录多能细胞中被认为是特别重要的。

近期，Aydan Bulut-Karslioglu等人在Nature Communications上在线发表了“Chd1 protects genome integrity at promoters to sustain hypertranscription in embryonic stem cells” 的文章，该文章报道了Chd1通过阻止ES细胞中DNA双链断裂(DSB)的积累，在启动子区域保护基因组完整性的新作用。

首先，作者利用Chd1- Flag敲入的ES细胞系，通过IP-MS鉴定Chd1的相互作用蛋白，鉴定到Chd1与Atm、Parp1、Kap1和Top2β等多种DNA修复因子相互作用，并通过ChIP的方法对其相互作用进行验证。在本项研究中，作者通过Covaris S2对染色质进行片段化处理，之后对得到的目的蛋白和相互作用蛋白进行Western Blot验证（图1d），用于后续实验分析。

图1. Chd1与ES细胞中双链DNA修复蛋白的相互作用。a.利用Chd1-Flag敲入的ES细胞系，通过IP-MS鉴定Chd1相互作用蛋白。b.c.免疫共沉淀蛋白的基因本体论分析和GO富集分析。d.Co-IP验证Chd1与的DNA修复蛋白相互作用。

之后，作者又通过qPCR结合免疫荧光的方法对Chd1 KO ES细胞中相互作用蛋白的表达及定位进行研究（图2），并进一步验证了在Chd1 KO ES细胞中DNA的修复受到了干扰，更加证明了Chd1与 DNA修复因子的紧密联系。

图2.Chd1 KO ES细胞的DNA修复信号被干扰。a.免疫荧光分析Chd1相互作用的DNA修复蛋白Atm和Top2β在对照组和Chd1 KO细胞中的表达定位。b. rDNA上DNA修复蛋白的ChIP-qPCR分析。

由于DNA断裂和转录之间被认为可能存在普遍联系，因此，作者又通过末端转移酶进行DSB标记，然后进行深度测序（DSB-Seq），结合DSB-qPCR发现， Chd1 KO ES细胞中广泛的双链断裂（DSB）主要聚集在转录起始位点（TSSs）区域，生物信息学分析发现，与非DSB倾向基因相比，DSB倾向基因在TSSs表现出更开放的染色质结构，核小体结构更不稳定，并且，DSB倾向基因的基因长度更长，启动子近端区域的GC含量更高。该部分进行测序的基因组打断步骤是采用Covaris S2超声破碎仪，作用条件为：5% duty cycle，intensity 4，cycles per burst 200，frequency sweeping for 4.5 cycles。

最终，作者提出一个模型，以此阐明在ES细胞中，Chd1通过阻止多能干细胞中DSB的积累而在启动子区域保护基因组完整性。

本文研究结果表明，超转录使ES细胞以及其他潜在的干细胞/祖细胞面临DNA断裂和基因组不稳定的风险，但这可以通过依赖Chd1的DNA修复来解决，在任何情况下，转录启动子上的Chd1活性都可以保护基因组完整性，这在干细胞生物学和癌症中具有重要意义。

参考文献：

Bulut-Karslioglu A , Jin H , Kim Y K , et al. Chd1 protects genome integrity at promoters to sustain hypertranscription in embryonic stem cells[J]. Nature Communications, 2021, 12(1).

值得注意的是，文中两处提到的Covaris S2 是一台已经停产了十年的设备。看到这台已经服役超过十年的老朋友依然可以在染色质剪切和DNA 剪切中稳定发挥，小编深感欣慰。Covaris S2 之所以宝刀未老，得益于AFA 技术的稳定性和可靠性，AFA 聚焦超声技术相比水浴超声能量更集中、处理时间更短、产热更低，使其超声波发生器能量不易衰减，具有更长的使用寿命。

继S2 之后，Covaris 又陆续推出一系列基于自动聚焦声波（Adaptive Focused Acoustics，AFA）技术的样本处理系统，遍布全球基因组中心。

Covaris AFA 技术除了可以进行基因组DNA片段化、染色质剪切 (ChIP)之外，还可以进行高效的微量样本制备、核酸蛋白等生物大分子的提取以及FFPE样本处理等，是蛋白质组学研究、临床多组学应用的有利工具。