💦 这里有个非常关键的问题--准备！确保你准备好了你需要的一切。

例如，是否准备好无菌移液管和枪头等，并且已经将特定培养基预热。说到预热：你最近有用水银温度计或酒精温度计检查过水浴锅温度吗？还是你盲目地相信显示器上的数字呢？事实证明，这往往是导致致命后果的主要原因之一。如果温度高于37°C，细胞将受到影响。如果温度太低，解冻时间就太长，细胞将会受到不可逆转的损伤。

💦 做好充分准备后，就到了第二个关键点--时机！

你只有五分钟的时间将细胞从液氮中取出，解冻，最后将其转移到培养箱中--时间不多，尤其是要把细胞竖直放在水浴锅中1-2分钟解冻--不要用漂浮物固定。所以需要快，同时，要对细胞温柔，不要剧烈的上下颠倒移动。有个非常生动的比喻：原代细胞就像人类一样。如果你试着轻轻地抚摸它们来唤醒它们，它们最终会起床--但它们上班会迟到。另一方面，如果你用力摇晃它们，它们会很快醒来--但会整天脾气暴躁。这就需要我们在速度和温柔之间取得良好的平衡。此外，要注意保持水浴锅清洁，不然细胞很容易污染。

💦 当细胞密度为70-90%时，这是细胞传代培养的理想时机。

细胞需要周围的朋友才能快乐--不是太少，也不是太多。同样，这和人类一样--我们大多数人在拥挤的地方会感觉不舒服。此外，与大多数细胞系相比，一些原代细胞在达到完全融合时就会发生分化，所以传代时细胞密度的控制非常重要。

💦 在培养瓶中选择合适的细胞密度可以带来双赢的局面，你可以拥有大量的细胞。同时，选择合适的胰蛋白酶和终止液对细胞消化解离非常重要。

胰蛋白酶的浓度非常关键，市面上销售的胰蛋白酶浓度大多数为0.05%或更高，可能会损害原代细胞。建议使用0.04%胰蛋白酶/0.03%EDTA溶液对正常人细胞进行传代培养，对细胞损伤小。

有人问：能用生长培养基来终止胰蛋白酶吗？一般需要使用浓度>10%的FBS来完全灭活胰蛋白酶，但原代细胞培养基大多是低血清或无血清的，如果加入高浓度血清来终止胰蛋白酶会影响后续细胞培养，因此强烈建议使用不含血清的胰蛋白酶抑制剂。

💦 许多实验室都有自己的冻存细胞方案，通常需要使用含有高浓度血清和二甲基亚砜的培养基，但是要知道血清中含有很多未知因素。

由于原代细胞对刺激反应强烈，血清会通过触发不受控制的信号通路来影响它们，此外，高浓度的DMSO也会损伤细胞。为了弥补这一点，你需要在开始培养前通过离心来清洗细胞--这同样会给你的细胞带来刺激。建议使用无血清，DMSO浓度非常低的冻存液，以利于提高细胞复苏后的活力。

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