在过去的十年，微生物群越来越显示出在健康方面发挥着重要作用。例如，肠道微生物群失衡似乎与II型糖尿病（T2DM）和心血管疾病有关。然而，尚不清楚与疾病有关的特定菌株或功能。Daniel Portik等人采用PacBio Sequel II系统对9个样品进行了测序，用获取的HiFi Reads进行了宏基因组组装、分类和功能分析。结果表明，从每个样本中产生大量完整的MAGs（宏基因组组装基因组）是可能的，其中一半以上的高质量MAGs 由一个contig实现了环化。同时发现，在9个小样本的研究中，健康患者和糖尿病患者在分类和功能方面的差异与大样本研究的结果一致，也与文献报道的结果一致。总之，长且准确的HiFi reads宏基因组分析揭示了T2DM与健康对照肠道微生物群在分类和功能上的重要差异。此外，长HiFi reads的宏基因组组装促使许多完整的MAGs 和大量完整的环状细菌染色体序列的恢复。

实验设计及数据

一共使用了9个样本，每组3个样本，分别设置了3个组：健康对照组、II型糖尿病+心血管疾病（CAD）组和仅II型糖尿病组。然后每个样本在Sequel II系统 8M的SMRT Cell上测序，完成HiFi数据输出。

图1：所有9个样本的HiFi reads数和平均HiFi reads读长。典型的产出为2.0–2.5M reads，平均读长为8–10kb。

组装

使用Canu1（v1.8）对PacBio HiFi数据进行特定设置，组装每个样品的HiFi reads。

图2：对每个样品的N50长度和组装contigs汇总。不同样品的N50长度和组装contigs差异很大。然而，大多数样本有40-70个contigs长度大于1Mbp。

宏基因组分箱

基因组分箱流程

1.用Minimap2将HiFi reads map到Canu contigs

2.使用MetaBAT2生成bins

3.CheckM评估bin的质量

4.选择最高质量的bins：

•>70%完整性

•<10%污染

•<10个contigs

5.使用GTDB-Tk进行高质量bins的分类

图3：每个样品（橙色）回收的高质量基因组bins的数量，通常包括15–25个bins。 对于大多数样本，超过一半的bins包含一个contig（蓝色）。 这些代表高质量的组装细菌基因组。

图4：1个对照样品（D1125）的基因组分箱结果示例。（A）Bin完整度（%）与污染度（%）的比较；（B）每个点代表一个独立的高质量bin，上面显示了所包含的contigs的数量。对于这个样本，21个bins中的12个（57%）由一个单一的contig组成，每个contig代表>98%的完整细菌基因组。（B）中显示了所有12个基因组的大小、平均覆盖率和分类鉴定；（C）展示了一个示例点图，用于将一个组装的基因组与其推断的参考基因组对齐。

使用MEGAN进行分类和功能分析

MEGAN6分类和功能分析工作流程

1.使用DIAMOND6将HiFi reads与蛋白质数据库（如NCBI nr或RefSeq）对齐

2.将DIAMOND输出文件转换为MEGAN6长read输入格式

3.在MEGAN6中执行分类分析和功能分析

图5: MEGAN6中的SEED viewer显示了主要功能类的层次结构树。条形图中显示了每个样本的不同类别代表，包括对照组（蓝色）、II型糖尿病+冠心病（绿色）和II型糖尿病（紫色）的样本。可以扩展功能类以检查不同子类中的表示形式。

图6：样本组前20项功能差异热图（H：对照组；D：Ⅱ型糖尿病；DC：Ⅱ型糖尿病+冠心病）。功能分类统计从MEGAN6导出。对照组与其他样品有区别。

图7：（A）中显示了样品中细菌种类/菌株的丰度差异的可视化；（B）中显示了基于分类学特征的样本主成分分析。对变化影响最大的细菌分类群显示为向量，指示了最大幅度增加的方向；表（C）详细列出了健康和糖尿病患者组中丰度变化最显著的20个物种。包含的“文献注释”详细介绍了特定物种的某些重要功能（尤其是与短链脂肪酸有关的功能）。

为了更好的向您推送PacBio SMRT测序技术的最新进展，基因有限公司开辟了专门的企业微信账号，实时解读最新PacBio研究进展。

长按并识别二维码并添加联系人，您将了解到有关高准确度长读长测序技术的最新进展，以及我们即将举办的线上线下活动。