2020年，PacBio在PAG（动植物基因组会议）大会上展示的最新的HiFi技术，引发了广泛的关注，同时科学研究者对PacBio SMRT测序技术在超大基因组组装方面的表现有了更高的期待。于是就有了后来广为人知的两周时间组装完成加州红杉27G超大基因组的壮举。在此之后，Elizabeth Tseng进一步对加州红杉进行全长转录本测序，揭示了这个超大基因组的复杂可变剪切，实现了超大基因组的六倍体分型。

加州红杉，Sequoia sempervirens, 是地球上最高最古老的生物之一。它仅沿着太平洋沿岸的一小片土地生长，大部分在加利福尼亚州。树木高大宏伟，通常高达300英尺，基因组大小高达27G。

本次研究中，Iso-Seq文库构建和测序工作由美国特拉华大学DNA测序和基因分型中心完成，一共拿到530万全长转录本reads，比对到的转录本范围从50 bp到14.2 kb，平均长度为2.9 kb (Figure 1.)。虽然大多数基因座只有1-5个同工型，但许多位点显示出复杂的可变剪切模式，突出了全长转录本测序的功能(Figure 2a.)。

Figure 1. Mapped redwood Iso-Seq transcript length distribution and isoform complexity

Iso-Seq数据一方面可以查看可变剪切的能力，另一方面可以直接根据序列预测ORF的能力。Figure 2b.中显示了一个非常有代表性的示例，基因PB.209显示了三个isoform，其中两个导致相同的ORF预测。BLASTN是针对“未知的mRNA”，但是当我使用预测的ORF进行BLASTP时，显示它与锌指蛋白的相似性高达50%。

Figure 2. Iso-Seq mapping example. (a) BLASTN hits a predicted DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 20-like transcript. (b) Alternative splicing at a putative zinc finger locus resulted in predicted ORF changes.

Figure 3. 显示了将phase基因组与phase转录组结合的来进行六倍体分型的案例。该基因座有六个基因组单倍体，但其中两个仅在非编码区有差异，因此IsoPhase仅报告了5个等位基因。并不是所有的IsoPhase基因座都看起来很清晰，因为Iso-Seq群集旨在识别可变剪切（外显子）级别的差异。

Figure 3. IsoPhase showing 5 distinct alleles. (top track) genome haplotigs mapped back to the contig; (middle) Iso-Seq full-length reads grouped and colored by IsoPhase-inferred alleles; (bottom) Iso-Seq transcripts. Note that, while there are 6 genomic haplotigs, two alleles diverge only in SNPs in the non-coding region of this locus.

为了寻找完全没有map到的基因或者缺失的基因，Liz T使用其自己开发的Cogent软件根据Iso-Seq转录本的k-mer相似性鉴定基因家族。确定基因家族之后，运行BLASTN来查看没有map或map不好的Iso-Seq基因家族是否在NR数据库有匹配。Figure 4.显示了一个Iso-Seq基因家族的例子，该家族包含两组转录本，间隔约300 kb。两组转录本均未完全map（soft-clipped at the end），并且对ATP依赖的解旋酶基因具有相同的BLASTN命中。基因组覆盖率显示该区域后半部分的覆盖率不均匀，表明存在潜在的组装问题。

Figure 4. Using Cogent to identify partially mapped Iso-Seq gene families that could identify genome assembly issues. (top) Mapped coverage and alignment of genomic HiFi reads, which were input to the Hifiasm assembly (bottom) Mapping of Iso-Seq transcripts.

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