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大师讲座配套解读：opvCRISPR是如何检测新冠病毒的？

2020-12-01

上周二（11月24日），NEB（北京）请到了复旦大学的王永明研究员为大家带来了精彩的*期大师讲座，今天由基因小编为您总结王老师的实验方法。

“opvCRISPR” 将 RT-LAMP 等温扩增与 Cas12a 切割报告探针的方法进行了整合，在单管中即可进行样本检测，无需在扩增后开盖，最大程度上避免了气溶胶污染的可能性。整个流程约45分钟，灵敏度可达单分子水平。该方法已经过临床样本验证，与qPCR法的吻合度达到100%。该成果于2020年10月26日在线发表于Biosensors and Bioelectronics（1区，IF 9.518 in 2019）

opvCRISPR检测方法的原理。在检测COVID-19时，从鼻咽拭子中提取20μL RNA模板，添加到RT-LAMP混合物中。RT-LAMP混合物被放置在管的底部，并用25μL油密封; CRISPR / Cas12a反应试剂加入盖子内。在65℃的RT-LAMP扩增40分钟后，摇动管子使Cas12a试剂落入管底与 RT-LAMP 试剂混合。一旦Cas12a核酸酶通过识别DNA靶点而被激活，它会切割ssDNA报告探针，在蓝光的激发下产生肉眼可见的荧光信号。

关键实验步骤

制备用于正对照的RNA

1、制备含有 T7 启动子及 S 基因（493nt）的质粒；

2、使用胶回收试剂盒抽提 PCR 扩增子；

3、以 PCR 扩增子为模板，使用HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit，在37℃孵育4h以合成RNA；

4、使用 DNase I 降解 DNA 模板；

5、使用 RNAClean XP Kit 纯化 RNA，并储存于-80℃备用；

6、 RNA 经定量后制备成浓度为 5 x 10^10 拷贝/μL的母液。

用作正对照的Cas12a介导的酶切反应体系

1、按下表制备反应体系

2、反应体系置于37℃孵育20min，于蓝光下观察检测。

opvCRISPR体系配制

1、按下表在离心管底部配制不含荧光染料的RT-LAMP体系；

2、在液面上覆盖25 μL的矿物油以防止蒸发；

3、按下表配制2X的Cas12a酶切体系，加入离心管盖中；

4、装有以上反应体系的离心管置于金属浴中，65℃孵育40min；

5、与管盖上的 Cas12a 酶切体系混匀；

6、置于金属浴中，37℃孵育5min；

7、在蓝光透照仪下观察荧光结果。

实验结果

结果显示，该方法灵敏度接近单分子水平。

(d) 模板10倍连续稀释后测得的 opvCRISPR 荧光信号值。N表示反应体系中未加入模板。

为验证该方法的准确性和可靠性，王永明团队选取了26例被感染的样本以及24例未感染样本，使用该方法检测，同时与RT-qPCR方法进行对比。结果显示两种方法的结果完全一致。

参考文献

Wang R, Qian C, Pang Y, Li M, Yang Y, Ma H, Zhao M, Qian F, Yu H, Liu Z, Ni T, Zheng Y, Wang Y. opvCRISPR: One-pot visual RT-LAMP-CRISPR platform for SARS-cov-2 detection. Biosens Bioelectron. 2021 Jan 15;172:112766. doi: 10.1016/j.bios.2020.112766. Epub 2020 Oct 26. PMID: 33126177; PMCID: PMC7586109.

基因小编说

NEB为广大用户提供高效实惠的体外转录试剂、可用于各种等温扩增实验的 DNA 聚合酶以及商品化的 Cas12a 蛋白，是病原微生物检测的好帮手。

基因有限公司自1998年起作为NEB中国区最早的合作伙伴之一，一直为您提供专业的产品咨询和技术支持。如需更多产品信息，请联系您身边的基因人。