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关于限制性内切酶，你想知道的这里都会有（下）

2020-10-20

您的分子生物学实验还在继续吗？

限制性内切酶是分子生物学实验中必然会用到的一类工具酶，用起来很简单，但似乎又有很多不太明白的地方。上次我们聊到了限制性内切酶的一些基本概念，比如酶活力单位、反应温度、反应buffer、酶的用量以及推荐使用的机器等。前情回顾：关于限制性内切酶，你想知道的这里都会有（上）今天我们来聊聊双酶切反应那点事。

使用两种限制性内切酶同时切割载体或外源片段，不仅可以有效避免后续连接反应中的载体自连，还可以让外源片段按照自己想要的方向插入载体中，是一种常见的省时方案。要确立一个双酶切体系，需要考虑最适合使用的buffer、最适合使用的温度、酶切的先后顺序等问题。

如何找到最适合使用的buffer？

由于绝大多数限制性内切酶在不止一种缓冲液中具有活力，我们需要找到一种缓冲液能让两种限制性内切酶都能有50%以上的活力。由于Cutsmart buffer可以兼容216种限制性内切酶，大多数时候它就是您的最优选择。除此之外，您可以采用以下四种方法：

中英文官网

NEB中英文官网的产品介绍中会列出该酶在四种常见缓冲液中的活性，通过对比两种酶的特点，找出最适合的缓冲液。

在NEB大目录中查找

NEB大目录中也会列出每一种酶在不同缓冲液中的活性，通过对比找出最适缓冲液。

Performance Chart

通过NEB限制性内切酶表现表（Performance Chart for NEB Restriction Enzymes）来查找最适合的缓冲液，该表随NEB大目录赠送给客户。小编当年做实验的时候，总会把这张表贴在冰箱上或者墙上，每次做双酶切前都要“趴墙找”。点击“阅读原文”，即可下载限制性内切酶表现表的电子版。

在线工具Double Digest Finder

使用NEB双酶切在线小工具（https://nebcloner.neb.com/#!/redigest），输入或选择您要用的两种酶的名字，即可看到两种酶的特点了。

点击表格上方的“Show Detailed Protocol”，还可以看到详细的实验步骤哦。

两种酶的反应温度不一样怎么办？

首先使用两种酶通用的缓冲液配制反应温度较低的内切酶的反应体系，在其最适温度孵育至反应完毕。再加入第二种酶，在其最适温度孵育。

没有共同缓冲液怎么办？

如果没有一个共同的缓冲液能让两种内切酶的活性均大于50%，则需要进行分步酶切。分步酶切的原则是先切盐浓度低的那种。NEBbuffer的含盐量从低到高依次为：NEBuffer 1.1 < NEBuffer 2.1 < Cutsmart buffer < NEBuffer 3.1。*步酶切完成后，用小体积浓缩盐溶液调整缓冲液中的盐浓度，直至满足第二种酶的要求后，加入第二种酶以完成第二步酶切反应。

也可以在完成*步酶切反应后对底物进行纯化，但会造成一定的底物损失。

未完但是这次不续了

为什么不再继续写了？因为干货满满的官方重磅资料出现啦！从限制性内切酶基本概念，到实验小tips，从常规酶切到琼脂糖内酶切，整整80页，《内切酶实用指南》助您做好酶切反应。请与您身边的基因人联系索取资料，数量有限，先到先得。

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