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抗体纯化经典三步曲，还可以这样做！

2020-09-08

近年来随着单克隆抗体（mAb）药物的市场不断增长，国内单抗药企业及CDMO公司发展迅速，伴随而来的是企业之间的竞争不断加剧，以及市场对于昂贵单抗药物的价格下调的需求，国内生物药企业在不断扩大产能的过程中尽可能降低生产成本，才能提高竞争力。随着生产规模的扩大和上游发酵工艺蛋白表达量的增加，下游纯化工艺面临更高的挑战。因此，不断寻求纯化工艺的优化策略，以及筛选更有效的纯化树脂始终被重视。提高抗体下游纯化工艺的经济程度取决于从细胞培养，料液收获到纯化和最终精制等一系列各种参数的微调。取胜之道在于拥有解决难题和找到新方法的能力，这些方法将以具有成本效益的方式提高纯化工艺效率。

下游工艺挑战

抗体下游纯化工艺中通常会遇到一系列的挑战，例如正确折叠的活性蛋白质产量低或下降，杂质如宿主细胞蛋白（HCP）/蛋白酶，宿主细胞DNA（HCD）的增加；如何平衡产量和选择性；色谱柱柱压增加；色谱柱效率降低，填料的使用寿命等问题。其中目标产物产量的降低和HCP含量增加可能相互关联，尤其如果HCP当中有可能包含可以降解产物的蛋白酶。生物负荷的不断积聚，造成色谱柱结垢或者降解，可能是造成柱压增高或者色谱柱柱效降低的原因。让我们以一个案例来阐述下游工艺优化调整的可能策略。

传统的抗体工艺纯化过程

传统的抗体层析纯化经典三步骤是（CEP）：(i) 目标产物的浓缩和有害杂质的去除(Capture), (ii) 进一步去除大量杂质(Enhance), (iii) 最后，去除剩余的痕量杂质和不需要的目标产物结构变体，例如目标产物的二聚体和多聚体(Polish)。

ECP策略

在这篇文章中，我们描述了在纯化单抗或其他IgG分子时改变色谱步骤顺序的好处。从传统的Capture-Enhance-Polish(CEP)策略转变为Enhance-Capture-Polish (ECP)策略，对进入捕获柱(Protein A亲和柱)的料液进行标准化，通过这种方式，可进一步的强化工艺、提高工艺重复性、提高产量，进而降低产品的销售成本(COGS)。

CEP策略是比较成熟的主流下游纯化单克隆抗体(mAb) 策略。然而它也有一些缺点。其中一个问题是，通常料液在有限的预处理后进行上样，导致大量的宿主细胞蛋白(HCP)和DNA (HCD)进入到Protein A亲和柱中，其中一些杂质还会被共洗脱进入产物中，也就是说传统的工艺中昂贵的Protein A亲和柱往往会暴露在大量生物负荷的*线。此外，上游细胞培养工艺可接受的优化和细胞死亡数量会导致这些杂质超载，而下游工艺却可能难以处理。这些杂质还可能导致宿主细胞蛋白(HCP)、蛋白酶降解目标分子，或者促进抗体分子多聚体的出现，或者造成Protein A 的降解和泄露。

本文提出的ECP纯化策略则多种好处，例如: 料液的“标准化”，延长下游步骤填料的使用寿命，提高工艺性能，如载量和纯度。在一个表达水平约为1 g/L的细胞上清纯化案例中，我们来详细阐释一下ECP策略的工艺过程（注意本文案例中还没有开发出一个完整的下游工艺，只是演示了不同的色谱步骤如何协同工作）。

使用WorkBeads 40TREN进行预处理和样品的标准化

该方法的*步色谱步骤是使用的WorkBeads 40TREN（一种耐高盐的填料），它是一种多功能阴离子交换柱，允许等渗细胞上清液无需稀释即可直接上样。在大多数情况下抗体分子等电点高于pH 7.4，因此会直接流穿而不与填料结合。几乎所有的HCD和大多数的HCP都将与之结合（减少95％），这意味着大多数高分子量物质（HMWS），如目标抗体的可溶性聚集物和寡聚物也将被去除。在经过WorkBeads TREN之后证明 HCD减少了99％（见表1）。填装有WorkBeads 40TREN的色谱柱的使用方法类似于在细胞培养的收获步骤后放置的可吸附再生过滤器。

另外，在2016年的一篇关于预先去除宿主细胞残留染色质可提高Protein A 亲和层析的捕获性能的文献中【1】，Pete Gagnon 详细对比了使用WorkBeads 40TREN预先吸附HCD后，可不同程度上提升不同品牌Protein A 亲和层析填料DBC的对比。另一方面，使用WorkBeads 40TREN预处理，还可以有效减少Protein A的泄露。

亲和捕获

使用WorkBeads affimAb 亲和柱捕获WorkBeads 40 TREN的流穿产物，WorkBeads affimAb是重组耐碱Protein A亲和填料。在HCD和HCP尽可能小的共洗脱下，载量和选择性之间达到了很好的平衡。AffimAb的洗脱液具有较高的纯度，HCP含量进一步降低，聚集体的百分比低于2％（见下表），回收率为95％。

阳离子层析精纯；逐步或线性梯度洗脱

用基于Protein A的亲和层析捕获mAb后，通常会在低pH下孵育以灭活病毒，许多抗体可能在这种情况下形成聚集体。为了去除这些多聚体，我们添加了使用强阳离子交换柱WorkBeads 40S的精纯步骤。本案例使用了两种洗脱模式：梯度洗脱和逐步洗脱。线性梯度表明使用WorkBeads 40S可以有效地将多聚体与单体分离，并且聚体可以降低至小于1％，产率为85％（下图，A和B）。逐步洗脱使得聚体减少到小于0.5％，产率为86％（下图3C和3D，表1）。注意这个案例中并没有进行载量优化，而是直接把低pH mAb溶液直接上样离子交换柱。通过载量优化，预计成品率将至少提高到90％。

表1. 每个色谱步骤及所有色谱步骤的性能汇总

[1] Advance chromatin extraction improves capture performance of protein A affinity chromatography. R.Nian et al./ J Chromatog. A 1431 (2016) 1–7.

结论

标准化进入到Protein A亲和柱的样本状态，而无需考虑细胞培养状态，细胞死亡程度和宿主蛋白/DNA的残留量，提高纯化工艺结果的重复性；

预先去除宿主残留蛋白质（HCPs）和DNA（HCD），保护Protein A亲和柱免受大量的生物负荷累积，延长Protein A亲和柱的使用时间，降低最终产品的销售成本（COGS)；

可一定程度上提升Protein A亲和柱的动态结合载量（10% - 20%）；

非常快速的去除宿主细胞中的蛋白酶，除可以保护单抗外，还可降低对其对Protein A的水解，减少Protein A配体的泄露；

更加容易实现分批上样，从而可允许使用更小体积的Protein A亲和柱，降低COGS。

本文案例中使用的WorkBeads 纯化填料出自与基因有限公司在中国区独家合作的Bio-Works品牌。Bio-Works专注于设计开发，生产和供应用于分离纯化抗体，蛋白质，多肽，寡核苷酸，病毒和其他生物分子的纯化填料，产品可用于生命科学与生物制药的开发与制造。其的（US9045566B2)短链交联方式可获得尺寸一致性刚性琼脂糖树脂WorkBeads，优化的孔隙率可带来产量和纯度的良好组合，可耐受更高柱压，缩短工艺时间。

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