1. 心脏发育的时空基因表达动态

研究者分别从4.5-5、6.5和9个孕后周(PCW)心脏组织沿着背腹轴分别收集了4、9和6个组织切片进行空间准录组测序，将三个阶段的空间基因表达谱进行降维和聚类，共确定了得到10个时空保守的聚类(见图D)，并将它们回溯到组织切片上。令人兴奋的是，这些簇与所有三个心脏中的特定解剖区域相对应（见图E-G）。接着，对解剖区域之间的差异基因表达(DGE)分析（见图H），并对每个簇的上调基因做了富集分析。从上述结果来看（研究4.5-9 PCW这个时间段），表明了空间基因表达是在胚胎发育早期建立并维持的，心脏内各区域间的基因表达差异比各时间点间的差异更明显。

2.单细胞测序分析6.5-7孕后周人类胚胎心脏

将心脏组织切开分成上下两部分（见图C）：上部分包括流出道、房室结构和心房的大部分，下部分包括心室。然后分别进行单细胞测序，然后降维聚类分成15个细胞cluster(见图B)。基于marker基因表达分类成15细胞类型，包括3种心肌细胞类型、心脏神经嵴细胞、施旺祖细胞、心外膜细胞、EPDC、2种内皮细胞、4种成纤维样细胞。

3.构建一个心脏发育的细胞基因表达图谱

为了阐明人类胚胎心脏中存在的不同细胞类型的空间分布及其空间域的异质性，利用ISS的亚细胞空间分辨率，将其应用于ST分析的三个心脏组织，使得以单细胞分辨率进行基因表达的时空分析成为可能。挑选了包含69个基因的panel，一部分来自ST鉴定的关键空间标记基因，一部分来自scRNA-seq中每个cluster的标记基因（免疫细胞除外），还有一些来自先前报道的对心脏发育很重要的基因。更后根据ISS、ST、scRNA-seq结果，利用算法构建一个完整的6.5孕周胚胎心脏的空间细胞图谱(见图A-B)。

4.通过空间分析解析细胞类型的相似性

首先展示了ISS、ST、scRNA-seq三种技术得到的结果是一致的（见图A-B），对3种细胞亚型（心肌神经嵴细胞、施旺祖细胞、心外膜细胞）的marker基因进行检测，显示心肌神经嵴细胞marker只在早期表达，施旺祖细胞marker只在晚期表达（见图C-D）。另外，在心外膜下间质内心肌神经嵴细胞不存在，施旺祖细胞只在其发育后期存在（见图E-F）。

更后，作者为了方便世界各地研究者使用他的研究成果，提供了一个公共可用的网络资源来可视化地探索调节人类心脏发育的空间基因表达模式。

(https://hdca-sweden.scilifelab.se/a-study-on-human-heart-development/).

4.17 空间转录组公开课，基因与您不见不散