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紫外可见光谱扫描--你所不知道的NanoDrop

2020-03-15

春暖花开

新冠疫情暂时平复了，小丽终于回到了日夜思念的工作岗位。可是刚来的蛋白分离纯化项目就给她泼了一盆冷水。分离方法、色谱柱、检测波长280nm都没有问题啊，为什么RPLC的色谱图目标蛋白的峰这么弱啊？正当小丽苦恼的仰天长啸时，一不留神看到了实验室新购入的新贵-NanoDrop One, “哎，听大张说买这台仪器是为了对未知蛋白或者化合物做紫外光谱扫描以确定物质更大吸收峰，难道......？”小丽拍了下脑袋，“对，先看下这个蛋白的更大吸收峰是不是280nm, 如果序列中不含有或者极少含有芳香环类氨基酸，更大吸收峰就有可能是别的”。果不其然，用NanoDrop One检测之后确认小丽的样品更大吸收峰在210nm。之后，小丽的实验就像开了挂一样，顺利拿到了纯化的样品。

故人新面

小丽用到的神器，NanoDrop One以及其搭配比色皿的OneC款超微量分光光度计，可是生命科学实验室居家必备之物，常常用作核酸、蛋白浓度、纯度的检测，是行业的标准。但是以上都是单光谱方面的应用，对于连续光谱，即紫外可见吸收光谱的应用，却只有少数高手能get到。要了解NanoDrop One/OneC的这一“隐蔽”功能，让我们从什么是紫外可见吸收光谱开始吧。

紫外可见吸收光谱

紫外可见吸收光谱(Ultraviolet Visible Absorption Spectroscopy)，也叫紫外光谱，是物质的分子吸收紫外光-可见光区（200-800nm）的电磁波时，电子发生跃迁所产生的吸收光谱。以光的波长或波数为横坐标，以物质对不同波长光的吸收强度为纵坐标可以做出吸收光谱。光谱峰值处对应的波长称更大吸收波长，以λmax表示。

吸收光谱描述了物质对不同波长光的选择性吸收能力。这是由于不同的物质，具有不同的特征能级和能极差，只能吸收与它们分子内部能级差相当的光辐射。由此，不同物质具有各自特征的吸收曲线，借此可以定性鉴定各种物质。

另外不同浓度的同一物质，它的吸收曲线形状与更大吸收波长是不变的，但吸光度随浓度增大而增大。显然，在更大吸收波长处测量吸光度，其灵敏度更高。因此，吸收曲线是吸光光度法选择测量波长的依据。

图示氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)光谱图

使用传统的分光光度计进行光谱扫描，存在样品需求量大，操作相对繁琐的问题。NanoDrop One/OneC超微量分光光度计能够提供190nm-840nm范围内的、固定步进为1nm的紫外光谱图。它使用起来简单、快速，并且只需要1-2ul样品就能完成检测。由于采用的是USB2000+光谱仪，具有更好的UV-可见光光电性能，全光谱扫描的时间是1ms，A/D转换器达到 2MHz。这些参数保证了读数的稳定性和精确性。接下来，我们具体了解一下如何使用ND One/OneC进行光谱扫描吧。

UV-Vis光谱扫描操作步骤

1. 在“主页”选择用户自定义，点击紫外-可见光

2. 如果需要设置监测波长，输入更多40个待监测波长，您也可以在扫描后需要时候再指定，或者不指定）。

3. 选择是否需要使用自动化光程调整和基线矫正。

4. 取1-2ul空白检测液点到下基座，放下检测臂。或将空白检测比色皿插入比色皿架。

5. 点击空白检测并等待完成。

6. 抬起检测臂，擦拭上下基座，或取下空白检测比色皿。

7. 取1-2ul待测溶液放置到基座上，放下检测臂点击检测。或将样品比色皿插入比色皿架，点击检测。

8. 检测完成，擦洗上下基座，或取下比色皿。

结果输出：

对于每个检测的样品，此应用显示吸光度光谱和结果摘要。要查看具体报告，可以在显示器上按住样品行显示，或者直接将所有数据用U盘导出。

注意事项：

1. 使用和待测样品溶液相同的缓冲液做空白检测。

2. 自动化光程，选择后允许软件为高浓度样品匹配更佳检测光程，避免样品稀释。取消选择所有波长的光程为10mm。

3. 基线矫正，可以输入指定波长（nm）,或者使用默认值750nm。

固定布局
工具条上设置固定宽高
背景可以设置被包含
可以完美对齐背景图和文字
以及制作自己的模板

再相识

其实，除了用于检测未知蛋白的更大吸收峰，NanoDrop One/OneC连续光谱扫描还可以实现以下应用：

杂质检测

当样品中含有杂质时，光谱图中可以观察到其他峰。通过测量特定波长的吸光度，可以检测出该杂质。如苯是环己烷中常见的杂质，通过在255 nm处的吸收峰可以进一步确认它的存在。

物质鉴定

在相同条件下，测定未知物和已知标准物的吸收光谱，并进行图谱对比，如果二者的图谱完全一致，则可初步认为待测物质与标准物是同一种化合物。当没有标准化合物时，可以将未知物的吸收光谱与《中国药典》中收录的该药物的标准谱图进行对照比较。如果二者的图谱有差异，则二者不是同一物质。

有机化合物结构分析

从吸收光谱图中峰的位置和组合可以判断化合物中是否存在共轭体系，推断其分子骨架，区分化合物的构型、构象和同分异构等，可以用来测定含有共轭双键、α，β-不饱和羰基（醛、酮、酸、酯）及芳香环化合物结构。

静待君来

好了，看到这里，小伙伴们有没有觉得这样的ND One/OneC笑起来更好看呢？实验室已经配有ND的小伙伴可以试一试它的全光谱扫描功能了，如果您实验室还没有，快快联系我们申请免费试用吧！

基因有限公司作为NanoDrop产品中国区独家代理商，为您提供更优质的售后服务保障，让您在使用过程中无后顾之忧，如您需要了解更多，快快联系您身边的基因有限公司员工吧。