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聊一聊低丰度蛋白质质谱检测的那些事儿（上）

2020-03-03

在质谱检测中，裂解液的成分组成影响着我们的蛋白提取效果及下游实验，有没有什么方法在不使用变性剂的情况下也能达到更佳的蛋白提取效果呢？

说起质谱检测，相信大家对田中耕一这个名字都不陌生，一位默默无闻的技术工人因为一次实验失误与其他2位科学家共享2002年诺贝尔化学奖，而获奖理由是“发明了对生物大分子的质谱分析法”。从此质谱成为研究人员常用的分析手段，在药物研发、临床诊断等领域得到了广泛应用。

基于质谱分析技术，我们不仅可以一次性地了解样品里都有哪些蛋白质，蛋白质都有多少，还能知道它们有没有翻译后修饰，修饰在哪个氨基酸上面，这种修饰的蛋白有多少。为了保证质谱的检测结果，一般都要求样品的起始量在10⁶个细胞或150mg左右的组织样品。但在我们的实际实验过程中，经常会遇到收集到的有效样本量有限，诸如蛋白激酶、转录因子等调控性蛋白又大多都是低丰度蛋白，那么对于微量样品或者说低丰度蛋白，如何提高质谱的检测效率就显得至关重要。

我们先来回顾下整个蛋白质谱实验的流程：

图片来源于网络

以上流程可以简单概括为三个部分：蛋白提取，肽段制备，上机检测。整个流程中想提高检测效率，更换灵敏度更高的质谱分析仪简单粗暴但前期投入太过昂贵，而对于肽段制备，市面上商品化的试剂盒五花八门，流程也已趋于标准化，我们只要按需选择更适的即可。思前想后，又回到了我们经常说到的话题：要想实验成功，赢在起步是关键。

作为整个质谱实验开始的步，蛋白质能否被充分释放出来？裂解后的产物对下游实验是否友好？这些问题都是我们在进行蛋白提取实验时需要思考的问题。选择不同的破碎方法及裂解液配方会导致我们的蛋白提取效果千差万别，那么对于微量样品或者说低丰度蛋白，怎样才能获得更佳的蛋白提取效果呢？今天我们先聊一聊裂解液成分及体积对蛋白提取的影响。

裂解液的成分及体积

8M尿素溶液是大家更常接触到的一种裂解液，算是一种比较强的变性剂，有时也会用6M的浓度，具有不电离、中性、成本低等特点，在实际使用中要求处理过程不能超过37℃，且需要将浓度稀释到1M以下才能使用胰酶进行酶解；

4%SDS溶解性较强，适合对膜蛋白及疏水性蛋白的提取，石蜡包埋样品的蛋白提取经常使用，但与胰酶不兼容，且很难通过超滤方法洗脱，一般需要用丙酮沉淀来去除；

总体来说，样品使用常规方法裂解处理后下游实验一般要进行超滤浓缩除盐，这些操作都会不可避免的带来样品损失，而对于本身量少、蛋白丰度低的样品更是雪上加霜，那么有没有什么方法在不使用变性剂的情况下也能达到更佳的蛋白提取效果呢？

答案是有，使用AFA聚焦超声技术在碳酸氢铵等溶液中轻松完成细胞样品的蛋白提取，无需脱盐，低至15ul的处理体积兼容不同的下游实验需求，是处理微量样品的一大利器。

血液或体液中的稀有细胞已被证明是某些疾病监测的具体指标或某些干细胞的来源，因为样本的体积有限且细胞浓度非常低，其蛋白组学分析一直是一个特别具有挑战性的问题。文章中使用Covaris AFA聚焦超声技术对重悬于15ul 25mM 碳酸氢铵溶液中的2000个细胞进行裂解处理，并与常规方法使用8M尿素进行普通超声后得到的蛋白质谱结果进行比较（上样量等同于500个细胞，结果如下）。

AFA技术与常规方法的蛋白提取效果比较（1）

从上图可以看出，在不使用变性剂的情况下AFA技术的处理可以有效的进行样品破碎，其处理2000个细胞获得的蛋白种类与常规方法处理10⁷个细胞所得的蛋白种类相当。此外，使用Covaris AFA聚焦超声技术处理的细胞可以在一管内完成还原、烷基化及酶解，所得肽段溶液可以直接进行质谱上样，无需脱盐处理，减少样品损失的同时大大缩短实验时间。

由此可见，蛋白质的充分释放和更大限度的减少蛋白损失是提高质谱检测效率的前提，优化我们的样品处理方法迫在眉睫！

那么本期关于裂解液成分及体积对蛋白提取的影响就先聊到这里，下期我们继续分享不同的破碎方法对于蛋白提取又有什么样的影响呢？

基于聚焦超声技术的高性能样本处理系统

参考文献：

1. Siyang Li et al. An Integrated Platform for Isolation, Processing, and Mass Spectrometry-based Proteomic Profiling of Rare Cells in Whole Blood. Molecular & Cellular Proteomics 14: 10.1074/mcp.M114.045724, 1672–1683, 2015

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