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如何保护抗体纯化工艺中昂贵的Protein A填料

2020-01-07

提高抗体下游纯化工艺的经济程度取决于从细胞培养，料液收获到纯化和更终精制等一系列参数的微调。取胜之道在于拥有解决难题和找到新方法的能力，这些方法将以具有成本效益的方式提高纯化工艺效率。这一点在纯化工艺中使用高价值的纯化填料时尤其如此。通常生物负荷和原位清洗的步骤会缩短纯化填料的寿命和载量，并威胁到产品质量和产量。因此，保护高价值的纯化填料，例如Protein A亲和层析填料，对于降低生产成本非常重要。

Troubleshooting your process

深入了解下游工艺开发的挑战和可用的解决方案是工艺开发成功的关键。正确评估工艺过程的关键质量属性（CQA）和关键工艺参数（CPP），并且需要对工艺过程进行全面监测。

工艺失控的警告信号可能包括：

🔹	正确折叠的活性蛋白质产量低或下降
🔹	杂质增加，例如HCP和HCD，蛋白酶或脂质
🔹	层析柱柱压增加
🔹	层析柱效率降低

目标产物产量的降低和HCP含量增加可能相互关联，尤其如果HCP当中有可能包含可以降解产物的蛋白酶。生物负荷的不断积聚，造成色谱柱结垢或者降解，可能是造成柱压增高或者色谱柱柱效降低的原因。结垢是一种累积过程，这个过程中可能会阻塞孔和/或阻塞树脂表面上的结合位点，从而降低填料的传质性能，并且可随之检查许多指标，包括：

🔹	测量层析柱填料的均匀性（塔板数，不对称性）
🔹	工艺图谱
🔹	产品产量
🔹	产品质量

沉积物之间的相互作用会影响结垢，而且清洗条件或步骤的变化也会影响结垢。让我们以Protein A亲和层析纯化抗体为例，来更详细地研究这些问题。

A case in point: Protein A column chromatography

单克隆抗体（mAb）的生产是生物制药行业的重要组成部分，而Protein A亲和层析对于单抗药物的稳健生产至关重要。在纯化高滴度IgG原料的步中，往往使用更先进，选择性更高的Protein A亲和层析填料。而Protein A亲和层析填料价格昂贵，在某些情况下可能占树脂总成本的50％至80％。随后再使用阴离子交换，阳离子交换和/或疏水相互作用层析进行精制，进一步去除HCP和HCD。这种广泛使用的传统方法将Protein A暴露在了大量生物负荷的线。为了在经济上可行，Protein A亲和柱必须循环使用数百次，尽管它们对NaOH的原位清洗（CIP）程序很敏感，而且即使使用苛刻的CIP方法，实际上也无法去除某些污垢成分。因此，提高Protein A亲和柱的性能和树脂寿命已成为下游工艺研发的重点。

许多因素会降低Protein A树脂的性能，包括：：

🔹	配体脱落或降解
🔹	孔的堵塞导致可用表面积的减少或树脂损坏造成填料床的劣化
🔹	降解Protein A配体的蛋白酶
🔹 🔹	脱落的Protein A与IgG非特异性结合，导致与抗体共洗脱由于琼脂糖基质成分中糖苷键的化学断裂造成pH循环期间基础介质的解体

通常通过测量动态结合载量(DBC)来监测Protein A亲和层析柱的性能。DBC高度依赖于操作条件，样品制备和样品来源。关于15家主要单抗药物制造商的调查显示，随着循环次数的增加，DBC不断降低且穿透曲线的斜率趋于平坦 [1]。受访者还看到树脂变色和洗脱峰加宽。该调查还显示，评价重复使用的树脂两个更重要的指标是产物中HCP的水平和特定蛋白酶的水平。其他重要影响包括产物中脱落的Protein A配体的水平，DNA浓度和脂质的含量。

Lintern和同事将结垢问题用清晰的图像表示出来，他们表明表面沉积物（结垢）的外观，Protein A亲和层析树脂载量的降低与不断残留的的HCP的增加之间存在相关性。诸如此类的观察促进了直观/定量评估结垢方法的发展，这可能是生物制药行业非常感兴趣的[2，3]。

A) Unused resin, B) after 50 cycles, C) 60 cycles and D) 100 cycles

Protection boosts process efficiency

传统的抗体纯化经典三步骤：(i)目标产物的浓缩和有害杂质的去除(Capture),(ii)进一步去除大量杂(Enhance), (iii) 更后，去除剩余的痕量杂质和不需要的目标产物结构变体，例如多聚体(Polish)。

由此可见，目前纯化抗体的策略基本上都是将生产中更昂贵的成分Protein A 亲和柱暴露于过量的生物负荷和剧烈的CIP程序中。问题是，我们能否保护这一关键组件免受损害，而又维持甚至提高整个工艺效率和经济性？实际上，确实有一种方法能够使杂质（HCP包括蛋白酶和HCD）早日快速去除。我们建议的改进策略是，颠倒传统纯化步骤的前两步，也就是在使用高选择性的捕获步骤之前，首先去除原料中潜在的有害成分，然后再进行捕获和后续的精制。我们称之为Enhanced Capture Process/ ECP。这种策略对产品纯度的提高和工艺性能都有明显的助益。

这种方法的有效性已经得到证明。例如，如上所述在纯化抗体时，在Protein A亲和层析的上游使用WorkBeads™40 TREN预保护层析，用以保护大量杂质进入Protein A亲和柱并降低对严苛CIP清洗的需要，从而延长Protein A亲和柱的使用寿命。

WorkBeads™ 40 TREN阻止杂质进入WorkBeads™ affimAb 亲和层析柱

WorkBeads™ 40 TREN 可有效提升Protein A 亲和层析的动态结合载量

基因有限公司独家代理的Bio-Works品牌，专注于设计，开发，制造和供应用于分离纯化抗体，蛋白质，多肽，寡核苷酸，病毒和其他生物分子的纯化填料，其产品可用于生命科学与生物制药的开发与制造。尤其是针对抗体药物纯化工艺，其中抗体纯化更是提出了独到的预保护纯化策略（ECP），预保护填料Workbeads 40TREN™作为Protein A亲和柱的预保护柱，可以去除99%的宿主残留蛋白质和DNA，不仅可以延长昂贵protein A 亲和柱的使用寿命，还可以提高protein A 柱的的动态结合载量，提高产量。节省昂贵的纯化费用，提高经济效益。

Re-use of Protein A Resin: Fouling and Economics, Pathak, M et al. BioPharm International, Volume 28, Issue 3, 2015
Residual on column host cell protein analysis during lifetime studies of protein A chromatography, Lintern, K. et al. J Chromatog. A, 1461 (2016) 70–77
Pathak, M. et al. Fluorescence based real time monitoring of fouling in process chromatography. Rep. 7, 45640; doi: 10.1038/srep45640 (2017)