核酸提取是分子类相关实验的步，核酸抽提质量的好坏直接关系到后续实验是否能够顺利进行。常规样品的核酸提取已经不是困扰实验者们的痛疾，让实验者们烦恼的多是一些特殊样本的核酸提取工作，比如粪便。

粪便样本是一类具有挑战性的样本。

        比如杂食动物的粪便如人、犬粪便，里面含有相对较高的水份并且粘性大；食草动物的粪便如兔子、羊粪便，含水量相对较少、富含纤维；干燥坚硬的粪便如老鼠的粪便，含水量极少。不同来源的粪便，含有的成份不同，样品的前期处理也不尽相同，比如裂解的用量，是否水浴加热等。

       粪便中包含食物残渣、脂类、多糖、蛋白、胆盐和PCR抑制因子等成份。有些成份比如蛋白、PCR抑制剂处理不当会随着提取过程进入核酸，造成核酸的纯度非常差，影响到下游的应用。

        今天小编就给您说道一下，粪便核酸提取过程中的注意事项。以提取粪便里面的DNA为例。

粪便样本DNA抽提流程基本包括如下的步骤：

我们的说道也就从这几个环节说起。

样品准备

       动物的粪便相比人的粪便，含水量较少，建议降低样本的上样量。

       小鼠、兔子的粪便甚是干燥，容易吸收裂解液，导致离心后上清体积不足，所以建议上样量降低或者增加裂解液用量。

        人的粪便也受到饮食习惯、身体状态的影响而有很大不同。一些高糖高脂饮食习惯的人群，粪便样本中的脂类含量很高，这样的样本会影响提取时的裂解效率，建议减少起始原料可以提高样品的裂解效率和核酸的纯度。

        此外如果人的粪便中含有未消化的食物，比如：粮食和水果外壳、未消化的种子等，请务必剔除出样本。

样本裂解

       欲得到高产出并且无污染的DNA，样本裂解非常的重要。

       含水量较低的粪便样本，除了上样量降低外，建议加入裂解液等比例的实验级水，防止样本的吸水，导致裂解上清过少。裂解液加入后摇晃2-3s 充分混均，短时加热（比如70℃），可以让样本裂解和组份溶解的更充分。食草动物比如：兔子、羊，无需样本加热，直接进行后续的组织匀浆。

       组织匀浆步骤离开不了物理破碎过程，比如机械碾磨珠。

       化学裂解液加上碾磨珠机械破碎，宿主和细菌细胞全被破碎。即使是干燥的固体粪便比如小鼠粪便，经过10min vortex处理也会破碎的非常完美。当然，破碎的条件需要根据自己的样本情况来适当的微调。目前已发现，陶瓷珠结合 Bead Tube Holder 在Vortex-Genie® 匀浆效果更好。

裂解液澄清

       离心是裂解液澄清更常用的也是更传统的做法。对于粪便样本来说，这样处理是不足以去掉粪便中复杂组份的。

       更好是在离心后的澄清裂解液中加入污染物沉降剂，然后在低温下比如2-8℃孵育一会，再次离心。

       这样就足够了吗？以上做法只是沉降了蛋白、残渣等物质，样本中的抑制组份还是需要专门的抑制剂去除柱Inhibitor Removal Column。

洗涤

       洗涤可以去除结合在柱膜上的多余的污染物。

       一般进行四部洗涤，结合液洗涤、高盐洗涤（胍盐）、低盐洗涤两次。建议第三次洗涤时，vortex 一小会，以便洗涤下来管体管盖上的胍盐。胍盐230nm 有吸收峰，胍盐去除不当会影响A260/A230比值。

洗脱

       洗脱时注意将洗脱液滴入柱膜的中心并且孵育1min,可以增加回收率。

       回溶洗脱液可以得到更高浓度的核酸。

以上是提供给大家的土壤DNA抽提的注意事项。

如果您试验中有积累下来的小经验欢迎联系我们。

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