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评估NGS级别FFPE RNA质量还在看RIN值?

2019-08-23

对于普通RNA样本质量评估，一般进行OD260/280检测纯度、Qubit检测浓度、Agilent2100 检测RNA Integrity Number（RIN）值评估完整度、电泳分析RNA降解程度等。但对于FFPE样本，由于没有统一的处理和储存标准，过程中容易产生不同程度的核酸降解和损伤，同时RNA 比DNA更容易降解，上述传统方法并不能完全恰当的评估提取的FFPE RNA样本质量是否适合RNA-seq。

例如许多人用RIN值来判断FFPE RNA样本质量是否适合下游文库构建。然而illumina 表示对于RNA文库构建，RIN值并不能有效评估RNA样本质量，因为相同RIN值的RNA样本片段分布可以相差很大。如下图用Agilent 2100 分析肿瘤组织FFPE样本纯化的RNA与标准Universal Human Reference（UHR）对比。可以看到这些样本即使RIN值非常接近（<3.2），RNA 的片段大小分布也相差非常大，大多数样本主要的RNA片段都小于200nt。

更近，基因有限公司独家代理的Covaris 的科学家们探讨了用于RNA-seq的FFPE RNA质量的具体评估指标，以期客观评价NGS级FFPE RNA。Covaris 用Covaris truXTRAC® FFPE kit +AFA超声（自动聚焦声波技术）方法和用传统手动抽提方法抽提来源于肾、肝脏、子宫的相同FFPE 样本RNA。除使用上述DV200值外，还用Qubit RNA IQ值评估提取的FFPE RNA质量，更严格的用Functional RNA Quantitation (FRQ)值评估了提取的RNA样本可扩增RNA量。

DV200值

illumina 推荐用大于200nt RNA片段所占比值即DV200值来评估用于illumina文库构建的RNA样本质量（见下表），DV200值小于30%的样本不推荐用于文库构建，随着DV200值越高，RNA input量可以减少。

从下图可以看出Covaris truXTRAC 提取的RNA DV200值显著优于传统Q厂家方法且DV200值均大于50%。

Figure 1: DV200 scores for both Covaris truXTRAC tNA Plus extraction kit and Competitor Q’s extraction kit, as measured by the Smear Analysis tool on the 2100 Bioanalyzer (200 to ~17,000 nt) for kidney, liver and uterus tissues (N=3 per tissue).

Qubit RNA IQ值

Qubit RNA IQ值基于简单的双染料检测以获取RNA质量及完整性数据。Qubit RNA IQ检测是在Qubit4.0上配合Qubit RNA IQ试剂盒完成，使用了两种独特的染料—一种可特异性与大片段、完整性好或具有高级结构的RNA结合，而另一种可选择性与小片段、降解的RNA进行结合。因此，二者相结合便可对RNA样品的质量及完整性进行快速的评估。类似于其他RNA质量评分系统，RNA IQ#也会提供1-10的打分结果，而越大的IQ#则意味着样品中存在着越多的大片段或具有高级结构的RNA。相反，越小的IQ值则意味着样品中的RNA主要由小RNA或三级结构不完整的RNA所组成。

如下图对比IQ值，Covaris truXTRAC 提取的RNA IQ值显著优于传统Q厂家方法。

Figure 2: Qubit RNA Integrity & Quality (IQ) Score using Covaris truXTRAC tNA Plus extraction kit compared to Competitor Q’s extraction kit for kidney, liver, and uterus

tissues (N = 3 per tissue).

FRQ值

Functional RNA Quantitation (FRQ) 值用于评估可扩增RNA的提取量。由于下游NGS应用包含几个酶反应步骤，这对于input RNA样本质量非常敏感。Thermo Fisher开发了基于RT-qPCR方法的FRQ值，是定量评价FFPE RNA的理想方法。在这一检测中只有质量足以使酶反应的RNA才能被qPCR定量。Thermo Fisher认为FRQ评分<0.2ng/μl的样品质量较差,容易建库失败或不能够产生可靠的测序结果。

如下图对比FRQ值， Covaris truXTRAC 提取的RNA FRQ值均大于0.2ng/μl，且显著高于传统Q厂家方法提取的FFPE RNA样本。

Figure 3: Functional RNA Quantitation (FRQ) Score using Covaris truXTRAC tNA Plus extraction kit compared to Competitor Q’s extraction kit for kidney, liver and uterus tissues. Samples falling below the red dashed line (FRQ score of 0.2 ng/μl) are considered to be poor quality and likely to produce poor sequencing results.

用Covaris AFA超声技术和Covaris truXTRAC FFPE tNA Plus Kit提取的RNA在三个独立的RNA评估质量指标中均优于传统Q厂家方法，帮助从FFPE样本中获得高质量RNA样本，从而在诊断文库中获取更多信息：

严格的完整性和功能性RNA 评估用Functional RNA Quantitation （FRQ）值评估；

FFPE RNA 质量可以用电泳 (Bioanalyzer 2100) DV200值评估；

评估大片段、完整的FFPE RNA提取可以用荧光染料法Qubit IQ 值。

点

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如何从FFPE样本中获得高质量核酸？

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参考文献：

1. (2016). Evaluating RNA Quality from FFPE Samples.Illumina.

2. (2017). Methodology for assessing quality of RNA from FFPE samples for the Oncomine Immune Response Research Assay.

3. (2018). Qubit RNA IQ Assay: a fast and easy fluorometric RNA quality assessment. Thermo Fisher Scientific.

4. Case Study: The ORIEN Project – Large Scale Integration of FFPE Material into a Multisite Research Alliance.

5. Ward PhD, Toby. The importance of proper formalin fixation of FFPE specimens. Personalis.