自2008年2月29日，欧洲罕见病组织发起了第一届“国际罕见病日”之后，每年二月的最后一天被定为“国际罕见病日”。

罕见病（Rare Disease），是指那些发病率很低的一类疾病，这些疾病往往是慢性的、严重的，甚至危及生命，是人类医学面临的最大挑战之一。尽管发病率低，但并不罕见。我国有2000多万罕见病患者，每年新增患者就超过了20万。据研究约有80%是由于基因缺陷所导致的，具有遗传性，但临床上却往往很难诊断。

大多数罕见疾病都有遗传病因，查明遗传的致病基因既可以进行具体诊断。甚至还可以根据致病基因制定治疗计划。然而，找到导致个体罕见病的遗传因素却并非易事。在过去的十几年，NGS技术在诊断罕见病方面取得了重大进展，但基于短读长测序技术的外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）也只解释了不超过50%病例的致病原因，仍有超过一半的罕见病无法得到诊断，没有确定致病变异。

对于这超过一半无法诊断的罕见病例，他们的致病变异都隐藏在哪儿了呢？

有两类变异非常具有挑战性：一类是我们可以看到但无法解释的变异，包括外显子组以外的基因组区域，而另一类是使用传统技术根本看不到的变异。

对于编码区外的变异，往往非常难以分析，尽管一些变异现在已进入常规临床检测。但整体上，非编码区域相较于外显子测序并没有受到同等水平的关注，也缺乏相应的方法检查分析，甚至许多专家也只能猜测这些区域中变异的功能。事实上也只有对非编码区域的进一步基因组学研究才能阐明并解决这些谜团。

而那些传统技术根本看不到的变异，也就是那些包括大的插入/缺失、重复扩张、易位，倒位等在内的结构变异，实际上也更好解决，这些变异往往太复杂或太罕见，微阵列无法找到，基于短片段序列的NGS技术也无法看清。那仅仅依赖长片段就够了吗？事实上，对于所有这些变异，不仅要检测它们，还要用达到单碱基的分辨率来表征它们，才有可能从根本解释致病的原因，以及发病的机制。

与通常用于WES或WGS的短读长测序平台产生的short reads不同，HiFi测序兼顾了长读长（可达25 kb）和高准确度（≥Q30），甚至可以跨越极大的结构变异。无论是精度还是广度，PacBio HiFi测序都为基因组变异提供了最全面的视图，除了能达到NGS可及的变异外，还能检测短读长不可及的更大、更复杂的变异。

随着2019年PacBio 推出HiFi测序，国际上已有越来越多的人类基因组测序项目，特别是罕见病项目采纳了这一技术。（点击下文中的标题链接可跳转访问详细内容）

位于美国Kansas州的Children's Mercy研究所正在开展的Genome Answer for Kids（GA4K）项目，将在未来7年内收集3万名儿童及其家人的基因组数据和健康信息，最终将建成首个包含近 10万个基因组的开放访问的临床数据存储库。这一项目的目的远远不在于收集基因组数据，更多则是为罕见病的致病原因找到答案。

GA4K中的一个试点项目中，科学家通过PacBio HiFi测序分析了 80 个基因组。高准确度长读长的HiFi测序能够进行高质量、全基因组的定相（phased）组装，避免了三重测序的需要，从而简化了分析个体基因组的过程。Pastinen 博士说，通过这些数据结果，该团队找到了PacBio HiFi测序可以捕获，而其他平台无法看到的致病变异的实例。

因此，他们对一些棘手的病例：如父母基因组不可用的儿童，或者被认为在高度重复序列中，又或者是NGS无法理想覆盖的区域中，可能存在巨大或复杂的致病变异的儿童，安排了 HiFi 测序方案：

例如，在对发育迟缓和癫痫发作的个体进行基因组分析时，HiF测序揭示了一个复杂区域中，短读长难以准确表征致病性变异。以及在另一个 4 岁的肝脾肿大女孩的病例中，其父母基因组无法用于分析，被生化诊断为 Niemann-Pick 病 C 型。HiFi测序明确显示了两个关键变异位于相关基因的不同等位基因上。因而通过变异的定相分析，科学家们能够对该疾病的潜在基因组学病因给予解释。

在一个包括肌张力障碍（dystonia）表型的，具有巨大挑战性的大型家系中，运用HiFi测序技术确定了一个高达数千碱基的五碱基重复插入。该重复插入与疾病的表型存在明确的相关性，即有插入的个体，明显受到了疾病影响，而无插入的个体则没有受到疾病的影响。这样达到结果“不仅说明HiFi测序技术在识别这些五碱基重复扩张序列方面具有极强的能力，而且还突出了继续生成对照数据集的重要性，我们可以开始从可能与疾病相关的变异事件中发现哪些是正常的。”

Genomics England最初创建的目的是提供100,000基因组计划——国家卫生服务 (NHS) 中最大的癌症和罕见病参与者全基因组测序疾病队列。该研究将对英国基因组学100,000基因组计划期间收集的一系列样本进行重新测序，这些样本之前使用短读长测序技术进行了分析。该研究旨在揭示长读长测序在识别与罕见疾病相关的基因突变方面的潜在操作和临床益处。

100,000 Genomes Projec能够在大约25%的罕见病患者中发现可操作的突变。这一项目的研究者们很高兴发现，PacBio HiFi测序技术可以识别基因组区域中短读长测序技术无法轻易获得的变异。希望在研究期间获得的更多新的见解，最终可能为罕见病患者带来新的治疗或临床试验选择。

渥太华大学附属的CHEO研究所领导的Care4Rare项目，主要致力于确定最难攻克的罕见病的遗传病因，其目标是将加拿大罕见疾病的诊断能力提高一倍以上，从而通过对患者的潜在疾病进行量身定制的管理来改善对患者的护理，并为罕见疾病提供新的见解。

多年来，我们使用了许多技术，并取得了巨大的成功，为许多家庭提供了答案，但仍然有一些家庭，我们无法得到答案，因为他们的基因变异无法被现有的技术所发现。而PacBio的HiFi测序将允许我们探索基因组的新领域，以找到这些家庭的答案，从而推进诊断护理，并提供对生物学新领域的见解。

SOLVE-RD- 解决尚未解决的罕见疾病，是由欧盟委员会资助的欧洲罕见病研究计划，为期五年（2018-2022），总预算为1500万欧元。旨在通过将新的检测工具应用于病例来改善罕见疾病的诊断和治疗。2019年，引进了PacBio Sequel II系统，对超过500个人类全基因组进行测序，以确定引起疾病的变异。

而在过去三年来，这一计划相关的研究机构荷兰奈梅亨的拉德布德大学医学中心（Radboudumc）一直在使用PacBio长读长测序技术来识别导致罕见疾病的隐藏变异。增加的全基因组测序能力使SOLVE-RD研究计划能够显著提高样本通量。

通过研究，Radboudumc团队发现使用PacBio系统可以更容易地识别可能导致色觉缺陷的X连锁变异，例如Bornholm眼病和蓝视锥单色盲。此外，他们使用Sequel测序平台进行线粒体DNA(mtDNA)测序，因为它效率更高。在CLL（慢性淋巴细胞白血病）癌症样本中进行基于PacBio扩增子的IGH突变分析在效率和灵敏度方面都有令人欣喜的表型。使用其他技术平台对CLL样本进行类似测序需要花费大量人力，需要耗时的后续测试，从而需要较长的检测周期。

2021年12月8日PacBio与加州大学洛杉矶分校（UCLA）在罕见的、未确诊的儿科疾病测序领域达成一项合作。 这项合作将利用PacBio的HiFi长读长全基因组测序（WGS）和针对RNA的全长转录本测序（Iso-Seq）对罕见病病例进行诊断。研究对象为已经使用短读长技术进行诊断的患者。加州罕见病中心主任、UCLA大卫·格芬医学院教授Stanley Nelson将主持这项研究。

通过临床测序证据研究（CSER）联盟和阿拉巴马州基因组健康计划（AGHI）等计划，HudsonAlpha的研究员Greg Cooper博士及其实验室已经对超过1467名患病儿童和约1511名父母的基因组进行了测序。他们发现了约27％患病儿童的遗传原因，从而可以进行更精确的临床诊断。

HudsonAlpha的研究人员在每个家族中发现了许多短读长测序以前遗漏的遗传变异。在这些新发现的变异中，研究小组确定了六个孩子中有两个的可能的致病变异，这意味着他们确定的DNA变异可能是造成该孩子疾病的原因。

在一个案例中，研究小组在一个名为CDKL5的基因中发现了可能的致病性DNA大片段插入，有将近7,000个碱基。（点击链接可了解详细解读）

虽然已知智力障碍（ID）与500多个基因变异相关联，但即使是使用目前最好的分析方法，其诊断成功率也不到30％。

日本横滨市立大学的相关研究小组报道了一对12岁的同卵双胞胎女孩的情况，这对双胞胎临床症状符合伴有畸形相和上睑下垂的智力发育障碍（IDDDFP），但尚无分子证据可证实该诊断。这一病例以前曾用基于短读长测序的全外显子组测序进行过分析，但未发现致病变异。在使用PacBio HiFi测序对这对双胞胎之一以及她们双亲的样本进行全基因组测序后，分析结果显示这对双胞胎基因组中存在数百种插入、缺失、重复以及7个倒位变异。通过分析，发现了一个在BRPF1基因上的12 kb倒位变异。这一变异破坏了BRPF1及CPNE9两个基因，并可能导致基因功能丧失。而BRPF1基因异常会与IDDDFP也有着直接的相关性。

更进一步，研究人员通过由HiFi数据表征的SNV构建了单倍型数据，结合家系数据，揭示了12 kb倒位变异来自母亲的遗传