目前，医学界存在大量福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织档案，为临床蛋白质组学研究提供了一个潜在的金矿。然而，目前的FFPE蛋白质组学缺乏标准化、效率、重现性和可扩展性的工作流程。在这里，作者提出了一个使用自动聚焦声波(AFA)超声和S-Trap样品处理的优化工作流程，直接溶解(HYPERsol)的高得率蛋白提取和回收，使FFPE样品的蛋白质组覆盖和定量可与快速冷冻组织相比(平均R= 0.936)。

脱烷基化、蛋白质增溶和多肽样品制备是蛋白质组学样品制备中的三个重要步骤。如实验条件表所述，作者分别比较了：

1. 传统的二甲苯-乙醇脱蜡过程(“X”)和直接溶解在含有5% SDS的缓冲液中(“D”)的脱蜡过程；
2. 探头超声(“P”)或Covaris AFA超声(“A”)提取蛋白；
3. 通过Wessel-Flügge甲醇-氯仿沉淀和溶液内蛋白质消化(“M”)或S- trap(“S“)进行蛋白质回收。

作者首先对比了不同方法对FFPE肝脏样品的溶解程度，和传统的“XP”（二甲苯-乙醇脱蜡、探针超声）工作流程相比，“XA”以及“DA”的方法溶出了两倍左右的蛋白质，剩余的不溶物也只有“XP”法的一半。其中“DA”的方法溶出的蛋白最多，剩余的不溶物最少（图1）。这说明Covaris AFA超声可以起到很好的蛋白质释放效果，结合5% SDS直接溶解的脱蜡方法，可以简单高效的处理蛋白样本。

与二甲苯-乙醇脱蜡、探头超声和甲醇-氯仿沉淀(“XPM”;“传统”)，5% SDS直接溶解、AFA超声和S-Trap的样品处理方法(“DAS”;“HYPERsol”) 结果多鉴定了37%的多肽(30432±1324到41643±1012)和24%的蛋白质(2653±87到3297±46)，非常接近瞬间冷冻的样品通过探头超声和S-Traps (FPS, 3517±18)的结果（图2）。

为了进一步探索HYPERsol工作流程的可行性，研究人员制作了了火山图，分别比较传统XPM和FAS以及HYPERsol和FAS提取的蛋白质谱结果（图3）。与FAS相比，传统的工作流程“XPS”共鉴定出了2956个蛋白，其中有120个蛋白被分离出来存在显著差异（101个蛋白被低估，19个蛋白被高估）。而使用HYPERsol，鉴定出的蛋白种类提高到3517个，而只有24个蛋白与FAS相比存在显著差异（6个被高估，18个被低估）。FFPE样品的HYPERsol蛋白提取流程更能反应出原始组织的组成，从而降低实验误差。

FFPE组织的蛋白质组学分析特别适合于识别新的免疫组化(IHC)标记物，以促进对组织形态学特异性不足的肿瘤的诊断。恶性周围神经鞘瘤(MPNST)就是其中一种很难诊断的肿瘤。MPNST尚无可靠的阳性免疫组化标记物。最确定的免疫组化目标是H3K27me3，但这些标记仅在全球大约一半的病例中发生了变化。尤其难以将MPNST与黑色素瘤和滑膜肉瘤等的组织学模拟物区分开来。

因此，作者将HYPERsol应用于32份存档的FFPE肿瘤样本(13份MPNSTs、10份黑色素瘤和9份滑膜肉瘤)，以确定新的候选免疫组化标志物。最老的样品已储存超过17年，结果显示储存时间与蛋白质鉴定数量无相关性。在总共鉴定的5410个独特的蛋白组中，大约91%的蛋白在每一种肿瘤类型至少一个病例中被检测到，这个数据从数字上说明了鉴别鉴别标志物的固有困难。作者首先验证了黑色素瘤免疫组化标志物S100以及滑膜肉瘤免疫组化标志物TLE1的特异性。S100A和S00B在黑色素瘤样本中特异高表达，而TLE1同样在MPNST样本中表达，这提示我们需要更好的肿瘤标志物来区分这两种肿瘤。接下来，该实验揭示了一些完全肿瘤类型特异性的蛋白：MPNST中为90，黑色素瘤中为54，滑膜肉瘤中为12（图4）。这为MPNST肿瘤免疫组化标记物的发现提供了重要线索。

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总之，HYPERsol能够从FFPE组织中进行高重复性的蛋白鉴定和定量，其结果与快速冷冻组织非常相似。SDS直接增溶、AFA超声和S-Trap样品处理的结合显著提高了蛋白产量，可能使空芯针穿刺活检或激光显微切割的样品等小样本的分析成为可能。我们预计，HYPERsol样品处理的低变异性将提高研究人员从FFPE样品中提取有意义的生物信息的能力，最大限度地减少样品制备引起的误差。此外，该方法快速，无需耗时、繁琐和有毒的脱蜡过程；样品现在可以很容易地制备多肽并在同一天进行分析。由于提供96孔板用于AFA和S-Trap样品处理，HYPERsol适合于自动化、高通量分析，对临床实施至关重要。因此，HYPERsol工作流将使全球的FFPE生物库获得新发现，从而有助于开启临床蛋白质组学的新时代。